理论上应使用超纯水，但在实际操作中，应根据不同的仪器要求、具体的实际情况灵活掌握。

理想的HPLC用水应为18.2mΩ/cm的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及CO2等。

MS检测器的要求最高。从实际使用的效果看，市售优质纯水或蒸馏水，如果水质新鲜，再过滤完全可以满足四极杆HPLC-MS检测的基本要求，但易受瓶子中塑料添加剂的污染。而对于研究级的飞行时间质谱的HPLC-MS，只有新鲜的超纯水才能满足分析的要求。

近些年来逐步普及的ELSD检测器，由于其特点，水中的颗粒将直接影响仪器的灵敏度和噪音，最好使用超纯水。

对于UV和DAD检测器，经过二次处理的各种水再过滤和脱气基本可以满足分析要求。如果水质好，不过滤和脱气一般问题也不大，有时去离子水也可勉强使用。从波长来看，低波长分析用水高于高波长分析的用水，梯度分析用水高于等度分析用水，尤其在紫外较底波长时，最好使用超纯水，否则极易出干扰峰，影响整个色谱图的质量。

示差和荧光检测器由于其灵敏度和 性，其用水比紫外要求还可以低一些。

除了从仪器的性能特点考虑外，不同使用部门，对水的要求也不尽相同，如质量监督部门应使用专门的仪器用水，有严格的质量保证，具有可溯源性。HPLC用水可以通过专门的纯水机或超纯水机来得到。按用途，超纯水可以分为二个大类，仪器专用和生物培养专用，仪器用的超纯水高配置的除了交换柱外，还有紫外灯和0.22um过滤头二个可配附件。由于其交换柱、过滤头、紫外灯是一次性消耗，成本，但质量保证，使用方便。去离子水重蒸，将去离子水经石英蒸溜或亚沸后使用，注意不能将所有水都蒸出来，蒸出3/4为宜，剩下的因离子和杂质含量高弃去，否则重蒸将行同虚设。二次或三次重蒸水，具体方法同上差不多，由于不同地区自来水初始的水质差别很大，出水率自己判断，同时要经常清洗，质量比较难控制。采用类似家用的纯水机，其采用反渗膜系统，出水率约70％，离子除去率在95％以上，水质略低于去离子水，后面加一个阴阳交换树脂，出水可达到15mΩ/cm，过滤后水质不低于市售的纯水或蒸馏水，使用方便。市场上桶装的纯净水或蒸馏水，水在1－10mΩ/cm之间，选择质优的产品基本可以满足HPLC分析要求，也不一定要过滤。

有些生产单位自己有类似级别的水如注射用水、电子厂的清洗水、锅炉蒸馏水等，过滤后可以直接使用。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。